القا تولید ریشه موئینه و بررسی توان تولیدی هیوسیامین و اسکوپولامین در ریشه های موئینه و گیاه بنگ دانه کُردی(hyoscyamus kordicus bornm.)

agrobacterium rhizogenesیک نوع باکتری گرم منفی خاکزی مسئول القاء ریشه موئینه در محل اثر است. این باکتری می تواند t-dna را که در واقع به اندازه چندصد kb از پلاسمید ri (القاکننده ریشه) برداشته شده است، از باکتری به سلول گیاهی منتقل کند. این باکتری عامل سببی در ایجاد ریشه موئینه در گیاه است. امروزه کشت ریشه موئینه از گیاهان توجه زیادی را به دلیل پایداری بیوشیمیایی و ژنتیکی آنها، رشد سریع و توانائی در تولید متابولیت های ثانویه در سطوحی قابل مقایسه با گیاهان اصلی ،به خود اختصاص داده است. سیستم ریشه شرایط کشت بدون هورمون بسیار پایدار بوده و تولید بالایی دارد. هیوسیامین و اسکوپولامین، تروپان الکالوئیدهای مهم از نظر دارویی هستند. به دلیل داشتن خاصیت خنثی کنندگی استیل کولین و نیروی فعال سیستم عصبی مرکزی استفاده ی درمانی آنها به طور وسیعی کارآمد است. این ترکیبات به طور گسترده ای در خانواده ی solanaceae سنتز می شوند. در این تحقیق از باکتریa. rhizogenes، سویه های a4,a13, a7, msu440,15834و pbi 121+gus استفاده گردید. جداکشت های برگ و دمبرگ از گیاهان 4 هفته رشد یافته، درسه نوع محیط پیش کشت( ms, ms + 2mg/ml bap , ms + 2mg/ml kin) برای مدت 1، 2 و3 روزآماده شدند برای انتقال به محیط هم کشت. زمان تلقیح باکتریایی 5 و 10 دقیقه مورد آزمایش قرار گرفت.مدت قرار گرفتن در محیط هم کشت، ? روزه و? روزه بررسی شد تا بهترین مدت زمان ماندن در این محیط تعیین گردد. القاء ریشه های موئینه از نظر محیط هم کشت نیز مورد بررسی قرار گرفت. در یک سری از ازمایشات از مقدار ??گرم ساکارز به جای ??گرم ساکارز استفاده گردید. بعد از دوره هم کشتی ، به دلیل رشد سریع باکتری در اطراف جداکشت ها، عمل انتقال آنها به محیط جامد انتخابی(ms+cephotaxim) صورت گرفت . این عمل هرهفته ? بار تا حذف کامل باکتری ها تکرار گردید. نتایج نشان داد که سویه a4 با 79% ، در محیط پیش کشت یک روزه حاوی ms+bap و زمان تلقیح 10 دقیقه و در محیط هم کشت حاوی 60 گرم ساکارز برای 2 روز بالاترین میزان ترانسفورماسیون را داشت. برای تائید تراریختی توسط ژن rolb از آزمون pcr استفاده شد. به منظور بررسی تعداد نسخه های وارد شده این ژن در ژنوم گیاه، سادرن بلات انجام شد، که وجود نسخه های تک این ژن در ژنوم گیاه به اثبات رسید. آزمون gus با روش .jefferson et al برای ریشه ها و گیاه تراریخت انجام گرفت. در نتایح حاصل از hplc مشاهده شد که میزان هیوسیامین و اسکوپولامین در عصاره ی ریشه موئینه تراریخت بیشتر بوده ، پیک بلندتر و سطح زیر منحنی قابل توجهی نسبت به میزان این دو آلکالوئید در برگ و ریشه غیر تراریخت داشت. ریشه های موئینه در محیط ms که شامل kin با غلظتmg/l 1و2،naa با غلظت mg/l 2/0 و 5/0 قرار گرفته بودند، بعد از حدود یک هفته نشانه های باززا شدن را ظاهر کردند.